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Autophagy LC3 Q&A



Q1  怎样进行饥饿诱导比较好?


Q2  Western Blotting检测LC3时使用多大的凝胶浓度合适?


Q3  Western Blotting能不能检测出LC3的条带?


Q4  关于WB检测出的LC3-I和LC3-II条带的解释,有介绍吗?


Q5  想进行细胞染色,需要注意哪些要点?


Q6  哪个细胞染色(IC)固定的方法好?


Q7  哪个组织染色(IHC)固定的方法好?


Q8  冰冻切片能染色吗?


Q9  推荐抗体有哪些?




Q1:怎样进行饥饿诱导比较好?

A1:NRK细胞培养,将培养基转换成Hank's Balanced Salt Solution(无血清),培育2~4小时诱导饥饿状态。无血清的  DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)也能诱导,但是由于含有氨基酸,诱导较弱。 

另外,根据细胞的种类不同,最佳条件可能多样,所以请充分研究所使用的细胞的条件。



Q2:Western Blotting检测LC3时使用多大的凝胶浓度合适?

A2:推荐15%。如果是10%, LC3-I和LC3-II的条带较近,识别困难。 



Q3:Western Blotting能不能检测出LC3的条带?

A3:请按照数据表确认以下几点。

●请使用含有SDS的样品配置缓冲液。推荐使用SDS-PAGE sample buffer (Laemmli's sample buffer)。

●使用单克隆抗体检测时,封闭后需要清洗。另外,此时使用0.05% Tween-20/PBS清洗(5分钟×3次),会发现LC3-II的信号增强。

● 作为WB的阳性对照,是HA标签融合重组蛋白质LC3(code no.PM036-P)。该产品可检测抗HA标签抗体和LC3抗体。由于HA标签融合,所以能比原来LC3检测出更粗的条带。



Q4:关于WB检测出的LC3-I和LC3-II条带的解释,有介绍吗?

A4:请参照以下的论文。关于LC3的WB数据的解释,有详细的解说。

         Mizushima N, Yoshimori T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3(6): 542-545, 2007 PubMed:17611390



Q5:想进行细胞染色,需要注意哪些要点?

A5:膜通透处理使用Digitonin (Sigma, D141)。溶液使用PBS(配置 最终浓度100 μg/mL)。不推荐使用Triton X-100进行膜通透处理。



Q6:哪个细胞染色(IC)固定的方法好?

A6:使用4% PFA/PBS。不推荐甲醇和丙酮固定等。



Q7:哪个组织染色(IHC)固定的方法好?

A7:请使用10%福尔马林溶液 (福尔马林量3.7%)或4% PFA/PBS。 



Q8:冰冻切片能染色吗?

A8:我们公司没有研究过在冰冻切片中使用。能保证在石蜡包埋方法中使用。



Q9:推荐抗体有哪些?

A9:根据实验应用不同推荐的抗体不同,参考以下。 

          WB:code no. M186-3、PM036

          IP:code no. M152-3、PM036

          IC:code no. M152-3、PM036

          FCM:code no. M152-3、PM036

          IHC:code no. PM036